Rohovka je důležitou ochrannou bariérou oka před nečistotami a bakteriemi, a zároveň pomáhá zaostřovat světlo na sítnici na zadním pólu oka. Zdravá rohovka je základem pro správné vidění. Poranění či poškození rohovky často vede k trvalé ztrátě její průhlednosti, což může značně oslabit nebo dokonce znemožnit vizuální funkci postiženého oka. Velká a výrazná rohovka koně je zvláště náchylná k přímému bolestivému traumatu, toxickému nebo infekčnímu útoku. Postižení rohovky koně bývá častým důvodem k návštěvě veterináře.

Rohovka se skládá z několika vrstev, přičemž nejsvrchnější vrstva je tvořena buňkami, které jí udržují dehydrovanou a průhlednou. Fakt, že rohovka nemá vlastní cévní zásobení nebo nefungují zde jiné systémy, které tělo obvykle využívá k podpoře hojení, může výrazně ztížit proces hojení a regenerace. Prognóza v těchto případech závisí na typu a základní příčině poranění, stejně jako na rychlosti stanovení diagnózy a vhodnosti zvolené léčby.

Imunitně zprostředkovaná keratitida

Imunitně zprostředkovaná keratitida (IMMK) je termín označující různá zánětlivá onemocnění rohovky, která nemají jednoznačnou příčinu, projevují se různorodými obtížemi, a jsou spojená s poruchami imunitního systému koně. IMMK různého stupně závažnosti může postihnout kteroukoli vrstvu rohovky. Přesná příčina IMMK není zcela jasná, ale většina případů souvisí s určitou poruchou imunitního systému, která narušuje normální funkci rohovky. 

Léčba se často zaměřuje na potlačení zánětu a modulaci imunitního systému. Jednou z inovativních terapeutických strategií je využití kmenových buněk, které mohou pomoci regenerovat poškozenou rohovku a zmírnit zánět.

Patogeneze

Při IMMK v rohovce dochází k různým typům buněčných reakcí vedoucím k lymfoplazmocytárnímu zánětu. Vývoj IMMK na molekulární úrovni je složitý. V postižené oblasti rohovky bývají přítomné pomocné pomocné a cytotoxické T lymfocyty, dochází zde také k prozánětlivé cytokinové reakci podporující angiogenezi.

Klinické projevy IMMK ovlivňují povaha antigenu, jeho množství a cesta prezentace, imunitní charakteristiky pacienta a imunitní prostředí v rohovce. Přestože IMMK může být vyvolána poraněním oka, většina případů se objevuje i bez něj. Hlavní klinickou charakteristikou IMMK je absence přední uveitidy.

Diagnostika

Diagnóza IMMK se zpravidla stanovuje na základě klinických příznaků a diferenciální diagnostiky, kdy se vyloučí např. akutní traumata, uveitida, glaukom nebo infekční keratitida. IMMK obvykle postihuje jedno oko a abnormalita rohovky může být pozorována již nějakou dobu před tím, než se projeví příznaky. Základními klinickými příznaky onemocnění jsou zvýžená opacita rohovky v nepřítomnosti uveitidy a absence hlubokého očního diskomfortu. Klinická prezentace IMMK je velmi variabilní, ale ve většině případů jsou přítomny následující příznaky:

• Vaskularizace rohovky: krevní cévy vstupují do rohovky na různých anatomických úrovních
• Edém rohovky: může mít různý rozsah – edém epitelu až po edém napříč celou tloušťkou rohovky. 
• Infiltrace buněk na různých anatomických úrovních.

Obecně lze IMMK klasifikovat podle toho, která anatomická vrstva rohovky je primární zánětlivou reakcí postižena, a to na IMMK povrchovou, stromální nebo endotelovou.

Různé typy IMMK u koní mohou mít různé projevy a vyznačovat se různým stupněm postižení rohovky. Povrchová IMMK se může projevit nerovnoměrným zákalem povrchu oka, který oko irituje a způsobuje nepohodlí. Tento typ keratitidy může být také doprovázen tvorbou nepravidelných shluků abnormálního epitelu na povrchu rohovky, což může působit další komplikace. Stromální IMMK postihuje střední vrstvu rohovky a může způsobit zamlžení nebo zákal oka. Mohou se objevit i další příznaky (např. subepiteliální usazeniny nebo tekutinou vyplněné dutiny v rohovce). Navzdory dramatickému vzhledu postižených rohovek je mnoho koní s touto formou IMMK relativně bez bolesti. Endoteliální typ IMMK postihuje vnitřní vrstvu rohovky a může vést k silnému zamlžení oka. Tento typ keratitidy může být doprovázen dalšími problémy, jako je zvýšený nitrooční tlak a tvorba zelených nebo oranžových skvrn v rohovce. V některých případech může docházet k vážným komplikacím (glaukom a ulcerace rohovky).

Terapie

Při terapii IMMK je důležitá včasná léčebná intervence, protože s narůstajícím časem stoupá rezistence na léčbu i náchylnost k recidivě. IMMK u koní obvykle vyžaduje dlouhodobou léčbu s kombinací imunomodulačních a protizánětlivých léků. 

Vzhledem k neznámému původu onemocnění a neznalosti spouštěcích faktorů je léčba primárně symptomatická (glukokortikoidy, NSAID a imunosupresivní léky samostatně nebo v kombinaci) a přináší různé výsledky. Dlouhodobé užívání steroidních protizánětlivých léků může vést až k degeneraci rohovky. 

Chirurgická řešení typu episklerálních implantátů cyklosporinu a lamelární keratektomie mají svá omezení. Episklerální implantáty cyklosporinu mohou mít u pacientů nereagujících na léčbu omezenou účinnost. Lamelární keratektomie, ačkoli úspěšná u některých refrakterních případů, je invazivnější a nese potenciální komplikace jako sekundární infekce a trvalá fibróza v místě keratektomie. Pro kontrolu IMMK je proto naléhavě nutné zavádět alternativní terapeutické strategie.

Využití kmenových buněk v léčbě IMMK u koní představuje nadějnou metodu léčby tohoto komplexního očního onemocnění, a to díky schopnosti kmenových buněk regenerovat poškozené tkáně a modulovat imunitní reakce. 

Mezenchymální kmenové buňky (MSC) byly donedávna ceněné zejména pro svůj hojivý a regenerační potenciál. Jsou schopné přeměnit se na specializované buňky rohovky, jako jsou keratocyty, epitelové buňky a endotelové buňky, a zlepšit optické vlastnosti rohovky. Posléze se pozornost vyvolaly jejich imunomodulační účinky, protože bylo zjištěno, že MSC regulují jak vrozenou, tak i adaptivní imunitu prostřednictvím sekrece cytokinů, což ovlivňuje různé funkce imunitních buněk. Díky schopnosti přímé imunomodulace jsou MSC slibnou terapií pro imunitně zprostředkovaná onemocnění.

MSC mají schopnost proniknout až do míst zánětu a vylučovat zde cytokiny, které mohou snížit fibrózu a modulovat imunitní odpověď. U lidí MSC regulují supresi T lymfocytární proliferace, čímž dochází k potlačení zánětu a dozrávání dendritických buněk a ke snížení produkce zánětlivých cytokinů. MSC u koní modulují imunitu prostřednictvím inhibice proliferace lymfocytů a indukce interleukinu (IL)-10. 

Na králičím modelu oka bylo prokázáno, že MSC urychlují hojení rohovky, snižují oxidační stres a potlačují vylučování prozánětlivých cytokinů, což vede k poklesu opacifikace a novotvorby cév na poškozeném povrchu rohovky. 

Tato zjištění naznačují, že autologní MSC mají potenciál být u koní účinnou léčbou imunitně zprostředkovaných očních onemocnění. 

Další studie zkoumla využití autologních MSC odvozených z kostní dřeně pro léčbu IMMK u koní. Terapii s autologní subkonjunktivální aplikací MSC podstoupili čtyři koně s jednostrannou IMMK, která nereagovala na standardní léčbu. Celkem byly zvířatům injektovány 3–4 dávky buněk v přibližně 1x za 14 dní. Klinické výsledky byly posuzovány podle průhlednosti rohovky, neovaskularizace a nepravidelností povrchu rohovky. Tři ze čtyř koní reagovali na terapii pozitivně, průhlednost rohovky se zvýšila a cévní prorůstání se snížilo. Výsledky naznačují bezpečnost a potenciální účinnost léčby IMMK pomocí autologní subkonjunktivální terapie MSC. Tento způsob podání buněk navíc cílí přímo na postiženou oční tkáň. K plnému pochopení mechanismů účinku a optimalizaci účinnosti terapie IMMK pomocí MSC je však zapotřebí další výzkum. 

Cílem belgické studie z roku 2023 bylo ověřit bezpečnost subkonjunktiválních injekcí autologních MSC získaných ze svalových buněk a zhodnotit jejich účinek u čtyř koní trpících závažnou chronickou IMMK, která nereagovala na standardní léčebu. MSC byly kultivovány z minimálně invazivních svalových biopsií. V kontrolní skupině dostali čtyři zdraví koně dvě subkonjunktivální injekce po 2,5 a 5 milionech buněk, přibližně v intervalu jednoho měsíce. Vedlejší účinky byly sledovány po dobu 1 měsíce po každé injekci. Ve skupině zvířat s IMMK obdrželo šest očí 4–7 subkonjunktiválních injekcí MSC (2,5 nebo 5 milionů buněk v jedné dávce) přibližně každé 4 týdny. K hodnocení vývoje očních lézí byl použit skórovací systém.

V kontrolní skupině všechny koně vykazovali mírnou až středně těžkou chemózu a hyperemii spojivky v místě vpichu, trvající 24–48 hodin. Ve skupině pacientů všechny postižené oči zpočátku pozitivně reagovaly na terapii, a to s významným zlepšením po první injekci. Celkem 4 ze 6 očí byly po celé období studie pod veterinární kontrolou, s pravidelnou injektáží MSC a bylo dosaženo lepších výsledků ve srovnání s dřívější konvenční léčbou. K recidivám došlo u tří pacientů, pouze jeden z nich reagoval pozitivně na zvýšenou aplikační dávku buněk. I když celkové skóre lézí nikdy nedosáhlo nuly, lze konstatovat, že zánětlivé stavy onemocnění, včetně buněčné infiltrace a aktivní vaskularizace, byly efektivně zvládnuty ve čtyřech případech. Nutno říci, že úplné vymizení fibrózy je u chronických případů keratitidy vzácné.

IMMK u koní je závažné onemocnění, které vyžaduje inovativní léčbné přístupy. Studie zabývající se využitím kmenových buněk přinášejí slibné výsledky a aplikace MSC, získaných z kostní dřeně a svalové tkáně, dokázala bezpečně a účinně snížit zánět a fibrotické změny v postižené rohovce. Výsledky výše uvedených studií naznačují, že terapie pomocí kmenových buněk může být cennou alternativou k tradičním léčebným metodám, zejména u případů, které nereagují na standardní léčbu. I když úplné vyléčení fibrotických změn není vždy dosažitelné, zlepšení stavu postižené rohovky a zamezení progrese onemocnění mohou zvířeti postiženému IMMK významně zlepšit kvalitu života.

I přes tyto pozitivní výsledky je třeba zdůraznit, že k plnému pochopení mechanismů, kterými kmenové buňky působí, a také k optimalizaci terapeutických protokolů, potřebujeme další výzkum. K potvrzení dlouhodobých účinků terapie MSC a k identifikaci nejúčinnějších způsobů jejich aplikace v případě IMMK u koní jsou třeba další klinické studie s větším počtem pacientů a standardizovanými postupy.

Zdroje:

• Brian C. Gilger (2022): Equine Ophtalmology Fourth Edition, Wiley Blackwell
• Cejka, C., Holan, V., Trosan, P., Zajicova, A., Javorkova, E., & Cejkova, J. (2016). The Favorable Effect of Mesenchymal Stem Cell Treatment on the Antioxidant Protective Mechanism in the Corneal Epithelium and Renewal of Corneal Optical Properties Changed after Alkali Burns. Oxidative Medicine and Cellular Longevity (Vol. 2016, pp. 1–12)
• Davis, A. B., Schnabel, L. V., & Gilger, B. C. (2019). Subconjunctival bone marrow‐derived mesenchymal stem cell therapy as a novel treatment alternative for equine immune‐mediated keratitis: A case series. Veterinary Ophthalmology (Vol. 22, Issue 5, pp. 674–682). 
• Gilger, B. C. (2022). Developing advanced therapeutics through the study of naturally occurring immune-mediated ocular disease in domestic animals. American Journal of Veterinary Research (Vol. 83, Issue 12). 
• Narinx, F., Sauvage, A., Ceusters, J., Grulke, S., Serteyn, D., & Monclin, S. (2023). Subconjunctival autologous muscle‐derived mesenchymal stem cell therapy: A novel, minimally invasive approach for treating equine immune‐mediated keratitis. Veterinary Ophthalmology. 

MVDr. Mária Vinczeová je členkou týmu projektu Avecell. AVECELL® je veterinární projekt Medicínského centra Praha, v němž se tým odborníků zaměřuje na výzkum a využití nových metod léčby pomocí aplikace kmenových buněk ve veterinární medicíně.