Technologie kolem embryotransferu koní se rozvíjejí tak rychle, že vyhlídky na nové a rozšířené možnosti asistované reprodukce jsou na dohled.

Autor původního textu: Christa Lesté-Lasserre, MA

Výše zmíněné důvody, ale i jiné, vás mohou vést k tomu, že po svém veterinárním lékaři budete požadovat embryotransfer, který umožňuje náhradní matce, tzv. příjemkyni, přijmout a donosit hříbě vaší klisny. Přesun embrya z jedné klisny do druhé je však obtížný proces, s nímž si poradí pouze zkušený odborník z oblasti koňské reprodukce. Ten by ho také měl provádět. Načasování úspěšného výplachu embrya z dělohy klisny může být složité, protože je možné ho realizovat pouze v určitou dobu. Nejčastěji se embryo transportuje do příjemkyně ihned, protože jeho zmrazení pro pozdější použití není u koní tak úspěšné jako u jiných druhů.

Nedávné pokroky v oblasti zpracování embryí a vajíček (vitrifikace, aspirace oocytů, intracytoplazmatická injekce spermie [ICSI] a in vitro fertilizace [IVF]), ve spojení s tradičním embryotransferem však poskytují majitelům klisen více možností, jak v tomto oboru dosáhnout vyšší úspěšnosti než dříve. Christine Aurich, DVM, PhD, vedoucí Graf Lehndorff Institutu pro koňskou vědu v německém Neustadt, a Maria Raymond Schnobrich, VMD, Dipl. ACT, odborník na plodnost koní v Rood & Riddle Equine Hospital, Lexington, Kentucky, nás provedou napříč těmito procesy - jak konvenčními, tak inovativními.

Tradiční proces

V současnosti v porovnání s dobou před několika desítkami let mají chovatelé mnohem více možností v oblasti reprodukce, a to téměř „na dosah ruky". Je dnes naprosto běžné hovořit o „tradičním" procesu embryotransferu, stejně jako o inovativních postupech včetně IVF nebo ICSI, které si oba popíšeme dále.

Při tradičním způsobu embryotransferu veterináři sledují ovulaci klisen transrektálním vyšetřením za pomoci ultrazvuku, někdy s použitím hřebce „prubíře", pro zjištění, v jaké fázi estrálního cyklu se klisna nachází. Zároveň veterinář odhaduje, kdy bude klisna ovulovat a poté uměle inseminuje čerstvým, chlazeným či mraženým spermatem od zvoleného hřebce. Sedm až osm dní poté se provede výplach dělohy a posouzení jejího obsahu. Izolují se všechna embrya z děložní tekutiny a jedno z nich je přeneseno do předem vybrané dělohy klisny příjemkyně. O týden později je veterinárním lékařem provedeno ultrazvukové vyšetření pro zjištění, zda se embryo uhnízdilo, březost započala a vývin je v normálu.

Krok první - synchronizace cyklu

Jedním z nejdůležitějších prvků úspěšného transferu embrya je synchronizace cyklů obou klisen, tedy dárkyně (která poskytuje embryo) a příjemkyně (která je březí až do porodu). Je důležité, aby děloha příjemkyně byla připravena přijmout a vyživovat embryo.

„Mnozí majitelé již vybrali svou klisnu příjemkyni, ale synchronizace jejího cyklu s cyklem dárkyně znamená výzvu a může představovat problém. Hormonální léčba, která zajistí, aby klisny ovulovaly ve stejný den, je hodně drahá," říká Aurich. „A majitelé za to obvykle nechtějí utrácet." Navíc, ne vždy funguje.

„Ani ustájení klisen na stejné pastvině jako podpora „přirozené" synchronizace zde moc nepomůže. Na rozdíl od všeobecného přesvědčení založeného na humánních studiích, zde to feromony neorganizují. Můžete mít stádo 25 klisen, každou v jiné fázi cyklu."

Nejlepší je mít možnost širšího výběru. Tento způsob umožňuje výběr klisny, která je přirozeně v cyklu nejblíže dárkyni. V podstatě jde o snahu napasovat vzájemně cykly klisen, než aby se klisny pasovaly do cyklů. Většina embryotransferových stanic má tak stáda klisen, ze kterých mohou vybírat, a chovatelé si mohou pronajmout tu vhodnější a po odstavu ji vrátit zpět do zařízení.

Například The Graf Lehndorff Institut nabízí stádo okolo 30 příjemkyň, Rood & Riddle okolo 60. „Čím větší stádo, tím lepší šance nalezení perfektně synchronizované příjemkyně," říká Schnobrich. Některá stáda ve Spojených státech a Argentině mají stovky takovýchto klisen.

Na velikosti záleží!

V nedávné studii francouzští vědci testovali vliv velikosti a plemene klisny příjemkyně na velikost a hormonální hladiny růstového hormonu hříbat, které přijaly. Pauline Peugnet, PhD, z francouzského výzkumného ústavu zemědělského v Jouy-en-Josas, a její tým transferoval embrya ponyho, jezdeckého koně a tažného koně do příjemkyň stejného plemene. Zatímco mnoho embryí šlo takto do odpovídajících velikostí a byla tak použita jako kontrolní, skupina provedla i transfery napříč smíšenými velikostmi, kdy bylo například embryo ponyho transferováno do tažného koně a embryo jezdeckého koně do ponyho.

Zjistili, že hříbata velkého koně z pony klisny vážila o 37 % méně než hříbata narozená jezdeckým klisnám, ale strávila v průměru dva týdny déle v děloze. Pony hříbata z tažných klisen se narodila o týden dříve než z pony klisny a navíc byla o 57 % těžší při narození. „Příjemkyně také ovlivňuje výšku v kohoutku, délku kostí v končetinách a tempo růstu," říká Peugnet. Mezi sourozenci hříbat narozených z různých druhů klisen se značně lišily i hladiny některých hormonů, například inzulínu, a další faktory, ovlivňující růst.

Umění mrazení a rozmrazování

Jednou z možností, jak odborník dokáže zachovat embryo v případě, kdy není okamžitě vloženo do příjemkyně, je zmrazení nebo použití metody zvané vitrifikace. „To přináší několik výhod," říká Aurich. Snad nejdůležitější je schopnost použít jako příjemkyni jednu konkrétní klisnu. Embryo se může rozmrazit a přenést až ve chvíli, kdy je požadovaná příjemkyně v optimálním bodě svého cyklu pro implantaci.

Kromě toho, kliniky nabízejí uložení takto zmrazených embryí po celá léta až do doby, kdy je chovatel chce použít, prodat nebo někam přenést. Je-li navíc z jednoho děložního výplachu nebo dárkyně získáno několik embryí v průběhu sezóny, tato embrya mohou být zmrazena a později přenášena do příjemkyní, které dosáhly optimálního bodu ve svém cyklu.

„Bohužel, koňská embrya nesnášejí proces mrazení tak jako ostatní druhy, například dobytek. Výstupky (protruze) okolo embrya zadržují vodu, která po zmrazení expanduje," říká Aurich. Proto se musí použít kryoprotektivum (látka pro ochranu tkání před poškozením mrazem) pro snížení tvorby krystalů ledu během procesu zmrazování. Tradiční mrazení má v současnosti okolo 25 % úspěšných březostí, na rozdíl od 80 % úspěšných březostí při přenosu „čerstvého" embrya.

„Vitrifikace (převedení tekutiny obklopující embryo na sklovitou hmotu pro zabránění tvorby ledu) vede k lepším výsledkům," říká Schnobrich. Výzkumníci z Texas A & M University zdokonalují metodu, při které odstraní ze sedmi nebo osmidenního embrya většinu jeho tekutiny před uložením do tekutého dusíku. Takto upravené embryo nabude svůj obvyklý tvar a objem tekutiny po rozmrazení a po přechodu množstvím roztoků. „Tento proces v současnosti slaví 70% úspěšnost zabřeznutí / živých hříbat a vychází na 600-700 dolarů na embryo," říká Schnobrich.

ICSI a IVF

Vědci dále zdokonalují proces přenosu embryí a snaží se najít způsoby, jak zlepšit své žebříčky úspěšnosti a praktičnosti. Embryotransfer nepředstavuje alternativu pro některé klisny kvůli nepřátelskému prostředí dělohy, nemoci nebo poškození vejcovodů nebo kvůli omezenému počtu spermií dostupných pro chov. Zlepšováky, jako jsou IVF a ICSI, se zvýšily šance na získání hříběte z právě takových klisen.

Intracytoplazmatická injekce spermie (Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI)

Při tomto procesu vědci aplikují jednu spermii injekčně přímo do zralého vajíčka, a to v laboratorním prostředí. K dnešnímu dni je po celém světě více než 300 ICSI počatých hříbat od uvedení postupu do praxe v polovině roku 1990.

V roce 2014 Schnobrichův tým začal nabízet aspiraci oocytů přímo z vaječníků pomocí ultrazvukově vedené jehly (namísto čekání na spontánní uvolnění při ovulaci). I když pro ovulaci v dané době mohou být dostatečně zralé pouze jeden nebo dva oocyty, veterinář může získat více - až sedm nezralých oocytů při jednom zákroku - a dopravit je do specializovaného centra ICSI pro dozrání a oplodnění. Z přibližně 20 % oplození se vyvinou transferu schopná embrya s následnou 65% úspěšností březosti/živého hříběte po transferu. Pokud je při jednom procesu vygenerováno více embryí, ICSI postup umožňuje chovatelům převést tato embrya do několika přijímajících klisen současně.

Jak ale technik pozná, která ze spermií oplodní dané vajíčko? Výběr je často založen na pohyblivosti spermie, morfologii, velikosti. ICSI embrya mají o něco vyšší míru předčasné ztráty - 20 % během prvních 30 dnů ve srovnání s 10 % při tradičním přenosu embryí. Schnobrich uvádí, že je to pravděpodobně kvůli vícečetnému postupu odehrávajícímu se mimo přirozené děložní prostředí při vývoji a přenosu embrya.
Aspirace oocytu také může vést ke komplikacím, jako je infekce, krvácení nebo tvorba srůstů.
I když jsou tato rizika nízká, je stále důležité mít je na mysli. „ICSI by ideálně měla sloužit klisnám, u kterých nelze provádět přenos embryí, nebo když je omezená zásoba ejakulátu," soudí Schnobrich.

Oplodnění in vitro (In Vitro Fertilization, IVF)

Francouzští a američtí vědci se snaží o úspěšnou produkci equinních embryí tím, že spojí spermie a vajíčka v laboratorních podmínkách a následně jim umožní přirozené oplodnění. To je časově méně náročné, vyžaduje to méně specializovaného mikromanipulačního zařízení a doprovodného personálu než u postupu ICSI. Zatímco žebříčky úspěšnosti IVF v lidské medicíně udělaly z této metody prakticky samozřejmost pro léčbu neplodnosti, u koní je to pořád docela náročné. Zdá se, že koňským spermiím a vajíčkům se v laboratoři nedaří a když už, embrya mají špatnou míru životaschopnosti.

Ghylène Goudet, PhD, vědkyně z Laboratoře reprodukce a fyziologie chování ve francouzském Národním institutu zemědělského výzkumu v Tours, pracuje na vývoji kapalného média, ve kterém dozrají oocyty (samičí pohlavní buňky - pozn. překl.), a podporují tak laboratorní oplodnění. Její tým nedávno studoval různá syntetická, přírodní a polo-syntetická média s cílem najít ten správný postup, který by spustil první znamení úspěšného embrya - difuzi pronukleů. Tedy proces, kdy se jádro vajíčka a jádro spermie rozptýlí a spojí do jednoho. Tento tým byl schopen oplodnit 72 % z desítek testovacích vajíček a až 100 % z nich dosáhlo šíření pronukleů. Toto jejich vítězné médium se nazývá Dulbecco's Modified Eagle Medium-F12 a je to velmi zvláštní směs aminokyselin, vitaminů, solí a glukózy vyvinuté v laboratoři.

Embryotransfer poskytuje bezpečný a spolehlivý způsob asistované reprodukce u klisen, které sportují, mají zdravotní problémy bránící porodu nebo potřebují vyprodukovat několik hříbat v sezóně. Koňské embryotransferové techniky se stále rapidně zlepšují a vědci pracují na zdokonalení postupů. V dalších letech pak doufají, že budou schopni nabídnout chovatelům celou řadu možností, které se přizpůsobí každému chovnému programu při respektování zdraví a dobrých životních podmínek zúčastněných koní.