Úspěšnost inseminace klisen v závislosti na době ovulace

Spojení člověka s koňmi trvá již 6000 let a Česká republika patří mezi země s tradicí v chovu koní. V minulosti se koně využívali převážně na práci, dnes jsou využíváni především pro sportovní účely, hipoterapii, agroturistiku nebo jako hobby. Při sportovním využití koně je potřeba se zaměřit na produkci kvalitních jedinců specializovaných na jednotlivé sportovní aktivity. Při vstupu České republiky do Evropské unie se usnadnil dovoz a vývoz spermatu od kvalitních zahraničních a tuzemských hřebců. Tito hřebci by měli působit v chovu jako zlepšovatelé a postupně zvýšit úroveň chovu koní.

Inseminační dávky těchto hřebců jsou využívány prostřednictvím tzv. umělé inseminace. Umělá inseminace je moderní biotechnologická metoda, při které je semeno hřebce uměle přeneseno do pohlavních orgánů klisny. Metoda je celosvětově využívána u všech hospodářských zvířat a usnadňuje zvýšení vlivu kvalitních plemeníků bez zbytečných transportů hřebců a možnosti jejich nákazy (pohlavní infekce, respirační onemocnění). Umělá inseminace není jedinou biotechnologickou metodou využívanou v chovu koní. Mezi další biotechnologické metody patří: embryotransfer, in vitro produkce embryí, sexace spermií nebo klonování. Řada metod je u koní ještě na začátku vývoje nebo jsou pro chovatele těžko dostupné jak po stránce finanční, tak technologické. 

Vlastní proces inseminace není složitý. Inseminace klisen se vykonává úplně vaginálně. Po detekci říje a výběru klisny se klisna přivede do prostoru určenému na inseminaci (fixační box) a tam se fixuje. Před inseminací se klisně spoutají pánevní končetiny nebo se zvedne hrudní končetina kvůli bezpečnosti (ŠŤASTNÁ a ŠŤASTNÝ, 2016). Kořen ocasu se ováže a odtáhne se na bok. Vnější pohlavní orgány se důkladně omyjí, osuší a vydezinfikují, aby se zabránilo kontaminaci pochvy (SAMPER, 2009).

Pokud je klisna připravená, z přepravní nádoby (přepravního boxu, nebo kontejneru na dusík) se vyjme inseminační dávka. Na inseminaci klisen se používají plastové katetry – pipety, na které se připojí injekční stříkačka nebo plastová nádobka s naředěným ejakulátem, případně rozmrazenou inseminační dávkou. Katetr má zpravidla délku 50–60 cm s průměrem 1–2 mm.

Samotná inseminace se provádí vaginální metodou s vizuální kontrolou nebo bez vizuální kontroly. Při inseminaci s vizuální kontrolou se používá poševní spekulum, které musí být sterilní a má přibližně tělní teplotu. Spekulum se opatrně zasune do pochvy, kde se rozevře. Pod kontrolou zraku se zavede katetr do krčku dělohy asi 10–20 cm hluboko, kde se deponuje inseminační dávka.

Jednodušší a rychlejší metodou je metoda zasouvání katetru pod kontrolou ruky (ŠŤASTNÁ a ŠŤASTNÝ, 2016). Špička inseminační pipety se umístí do sevřené ruky a na zadní stranu ruky se nanese sterilní nespermicidní lubrikační gel. Zakrytá ruka a inseminační pipeta jsou zavedeny do pochvy až k vnější brance krčku dělohy, kde inseminátor identifikuje děložní krček a opatrně zavede inseminační pipetu do dělohy, kde deponuje inseminační dávku (BRINSKO a kol., 2011). 

Detekce říje

Schopnost detekovat říji a inseminovat nebo připouštět klisny v termínu ovulace je jedním z nejdůležitějších předpokladů úspěšné reprodukce. V chovu koní je detekce říje pracná, každodenní a čas vyžadující činnost v sezoně páření. Zároveň je i činností, která vyžaduje jistý stupeň odbornosti, protože říje klisen je především procesem kaskádovitých změn v chování klisen v souvislosti se změnou v dominanci hormonálního řízení (ŠŤASTNÁ a ŠŤASTNÝ, 2016). K určení doby ovulace můžeme využít rektální vyšetření folikulu na vaječníku sonografem a palpací, rektální vyšetření dělohy sonografem, fenomén tažnosti cervikálního hlenu a délky říje vzhledem k individualitě jedince a ročnímu období (DUŠEK a kol., 2011).

Ačkoliv existují i alternativní metody detekce říje klisen, nejefektivnější je použití hřebce na zjištění ochoty se pářit. V chovech s problémovou detekcí říje je vhodné využití alternativních metod zjišťování březosti. Mezi alternativní metody patří zjišťování vaginální impedance, zjišťování říje androgenizovanou klisnou (ošetřená testosteron propionátem), měření tělesné teploty, měření teploty mléka (v první poporodní říji), zjišťování hladiny progesteronu (ŠŤASTNÁ a ŠŤASTNÝ, 2016). Aby se maximalizovala účinnost šlechtitelského programu a v konečné fázi i míra březosti, je přesné načasování ovulace důležitou součástí chovu (SAMPER, 2009). K ovulaci obvykle dochází 24 až 48 hodin před koncem říje (MCKINNON, 2011). Při inseminaci zmrazeným spermatem je vhodné klisny inseminovat těsně před nebo po ovulaci. Tato technika vyžaduje vícenásobné vyšetření, úsilí a náklady (AVANZI, 2015).

Metodika

Do sledované skupiny bylo zařazeno 49 teplokrevných klisen ve věkovém rozmezí od 3 do 20 let. U klisen byla sledována doba ovulace a doba inseminace čerstvým chlazeným, nebo mraženým spermatem, vliv použitého spermatu na zabřeznutí a vliv věku na zabřeznutí na první říji v daném roce. V rámci pokusu bylo provedeno celkem osmdesát inseminací.

Klisny byly před připuštěním vyšetřeny ultrazvukem Aloka SSD-500, aby bylo možné co nejpřesněji určit dobu ovulace. Při inseminaci čerstvým chlazeným spermatem byly inseminovány před ovulací a ovulace nastala nejdéle do 72 hodin. Ovulace byla kontrolována po 24 hodinách. Kontrola březosti byla diagnostikována také na základě sonografického vyšetření, a to 15. den ode dne, kdy byla diagnostikována ovulace.

Při inseminaci mraženým spermatem byly klisny vyšetřovány v časových intervalech podle změn na děloze a vaječníku, kde dozrával dominantní folikul. Při zjištění říje byly vyšetřovány po 24 hodinách. Při ustávání příznaků říjné dělohy (tzv. loukoťové struktury) byly klisny vyšetřovány v intervalu 4 až 6 hodin. Při změně kulovité struktury folikulu na protáhlý tvar byly klisny vyšetřovány v intervalu do 2 hodin. Po ovulaci byly klisny inseminovány mraženou dávkou spermatu. Kontrola březosti proběhla taktéž 15. den od inseminace.

Statistické vyhodnocení dat

Pro statistické vyhodnocení výsledků byl použit program Statistica.12 (Tibco) a Microsoft Excel. Vyhodnocení vlivu sledovaných faktorů bylo provedeno pomocí chí-kvadrát testu, který porovnává pozorované a očekávané četnosti. Dále byl použit dvouvýběrový t-test pro nezávislé vzorky. Všechna hodnocení byla provedena na hladině významnosti α = 0,05.

Výsledky

Neprokázal se vliv uskladnění inseminační dávky na březost (p-hodnota > 0,05). Úspěšnost zabřezávání v případě mraženého spermatu byla 52 %, u chlazeného spermatu pouze o 6 % vyšší, tedy 58 %. Z výsledků vyplývá, že při správném postupu chovatele lze dosáhnout podobné úspěšnosti chlazeným a mraženým spermatem. Při aplikaci mražené dávky se provádělo více sonografických vyšetření k přesné detekci ovulace v porovnání s aplikací chlazené inseminační dávky. Z výsledků vyplývá, že bylo dosaženo téměř stejného procenta zabřezávání u obou typů uskladnění spermatu i přes zjištění jiných autorů WATSON (2000), AMANN a PICKETT (1987), VIDAMENT a kol. (1997), že mražená inseminační dávka má zhoršené oplozovací schopnosti v porovnání s chlazenou. 

Tabulka č. 1: Pozorované četnosti při hodnocení vlivu typu uskladnění spermatu na zabřezávání klisen chí-kvadrát testem

Při sledování věku u zabřezlých a nezabřezlých klisen na první říji nebyl zaznamenán statisticky průkazný rozdíl (p-hodnota > 0,05). Průměrný věk klisen, které nezabřezly, byl 10 let (n = 19), devítileté klisny problémy se zabřezáváním neměly (n = 30). I v tomto případě působení chovatele eliminovalo v literatuře zmiňovaný negativní vliv věku na úspěšnost zabřezávání.

Graf č.1: Grafické znázornění výsledku dvouvýběrového t-testu, který hodnotí vliv věku na zabřeznutí na první říji a inseminaci

Ani v případě intervalu mezi ovulací a inseminací nebyl prokázán vliv tohoto faktoru na zabřezávání. Větší interval mezi ovulací a inseminací mraženým spermatem byl zaznamenán u zabřezlých klisen (3,25 hod) v porovnání s klisnami, které nezabřezly (2,50 hod). Rozdíl byl však v průměru pouze 0,75 hod a nebyl statisticky průkazný (p-hodnota = 0,32). V případě využití chlazeného spermatu k inseminaci měly zabřezlé klisny v průměru interval mezi inseminací a ovulací 38,88 hodin a ty, které nezabřezly, 35 hodin. Průměrný rozdíl 3,88 hodiny v délce intervalu mezi inseminací a ovulací nebyl prokázán jako statisticky významný u zabřezlých a nezabřezlých klisen (p-hodnota = 0,39). V rámci sledování však žádný časový interval nepřesahoval doporučenou délku.

Tabulka č.2: Výsledek dvouvýběrového t-testu, který hodnotí vliv intervalu mezi ovulací a inseminací mraženým spermatem na zabřeznutí 

Tabulka č.3: Výsledek dvouvýběrového t-testu, který hodnotí vliv intervalu mezi ovulací a inseminací chlazeným spermatem na zabřeznutí

Závěr

Závěrem lze konstatovat, že chovatel je schopen svým přístupem snižovat působení negativních vlivů na zabřezávání klisen. V rámci výsledků této práce nebyl prokázán vliv věku klisny, intervalu mezi inseminací a ovulací či typu uskladnění inseminační dávky. V praxi je tedy možné u umělé inseminace dosahovat optimálních výsledků zabřezávání klisen při dobrém načasování a správném provedení.

Seznam literatury:  

• AMANN, R.P. a B.W. PICKETT. Principles of cryopreservation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. Journal of Equine Veterinary Science [online]. 1987, 7(3), 145-173 [cit. 2020-06-12]. DOI: 10.1016/S0737-0806(87)80025-4. ISSN 07370806. 
• AVANZI, B.R., R. dos Santos RAMOS, G.H.M. ARAUJO, et al. Fixed-time insemination with frozen semen in mares: isitsuitable for poorly fertile stallions? Theriogenology [online]. 2015, 83(9), 1389-1393 [cit. 2020-02-03]. DOI: 10.1016/j.theriogenology.2014.07.007. ISSN 0093691X. 
• BRINSKO, S.P. a T.L. BLANCHARD. Manua lof equine reproduction. 3rd ed. St. Louis, Mo.: Mosby/Elsevier, c2011. ISBN 978-032-3064-828.
• DUŠEK, J. Chov koní. Vyd. 3. Praha: Brázda, 2011. ISBN 978-80-209-0388-4.
• MCKINNON, A. O., ed. Equine reproduction: Volume 1. 2nd ed. Chichester, WestSussex, U.K.Wiley-Blackwell, 2011. ISBN 978-0-8138-1971-6.
• SAMPER, Juan C. Equine breeding management and artificial insemination. 2nd ed. St. Louis, MO: SaundersElsevier, c2009. ISBN 978-1-4160-5234-0.
• ŠŤASTNÁ, D. a P. ŠŤASTNÝ. Špeciálna reprodukcia zvierat. Nitra: Slovenská poľnohospodárska univerzita v Nitre, 2016. ISBN 978-80-552-1511-2.
• VIDAMENT, M., A.M. DUPERE, P. JULIENNE, A. EVAIN, P. NOUE a E. PALMER. Equine frozen semen: Freezability and fertility field results. Theriogenology [online]. 1997, 48(6), 907-917 [cit. 2020-06-12]. DOI: 10.1016/S0093-691X(97)00319-1. ISSN 0093691X.
• WATSON, P.F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Animal Reproduction Science [online]. 2000, 60-61, 481-492 [cit. 2020-06-23]. DOI: 10.1016/S0378-4320(00)00099-3. ISSN 03784320. 

Zpracováno v rámci projektu MZE-RO0719

Ing. David Vacek, Výzkumný ústav živočišné výroby, v. v. i., Praha-Uhříněves

Článek byl otištěn v časopise KONĚ Asociace svazu chovatelů koní České republiky.